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常見問答

體外診斷試劑的主要類型和技術原理?

體外診斷試劑被廣泛應用于醫學科研與臨床檢驗中,因質量穩定、效果可靠,其不但為科研和診療提供了依據,也為疾病的預防、控制提供了技術資料。


體外診斷試劑品類繁多,涉及眾多學科門類,因學科間交叉現象日漸增多、新技術層出不窮,很難以某個原則為標準對其簡單分類。從臨床專業角度可將其分為臨床血液學體液檢驗類試劑、臨床化學類試劑、臨床免疫學試劑,及微生物學、細胞組織學、分子生物學試劑等;從方法學角度可將其分為化學顯色法、免疫比濁法、酶聯免疫法、膠體金法、免疫熒光法、化學發光試劑、分子生物學試劑、免疫組化試劑、免疫細胞化學試劑等。


臨床生化試劑主要用于配合半自動和全自動生化分析儀等儀器進行檢測。常用的臨床生化試劑所采用的分析方法和技術原理有多種,具體介紹如下。




光譜分析技術 


該技術是基于物質與輻射能作用時,測量由物質內部發生量子化的能級間躍遷而產生的發射、吸收或散射輻射所具有的波長和強度,從而進行分析的方法。按作用對象的不同,光譜分析技術可分為原子光譜法(測量離子、微量元素等)和分光光度法;按獲得方式的不同,該技術可分為吸光光度法和發射光譜法。


吸光光度法是根據溶液中物質對光選擇性吸收的特性進行分析的方法。有色溶液對光線有選擇性吸收的特性,不同物質由于其分子結構不同,對不同波長光的吸收能力不同,每種物質都有特定的吸收光譜。當一定波長的光通過該物質的溶液時,根據物質對光的吸收程度(吸光度)求出該物質含量的方法稱為吸光光度法。


吸光光度法可分為比色法和分光光度法兩大類。比色法又可分為目視比色法和光電比色法。分光光度法與光電比色法的原理類似,都是通過光電池或光電管測量溶液透光度的強度,來進行分析的方法。


當利用比色法測定溶液中的某種化學成分時,通常需加入顯色劑,使其產生有色化合物,顏色的深淺與待測化學成分的含量成正比,可據此測定待測物的濃度。


發射光譜法是通過測量物質的發射光譜的波長和強度,來進行定性和定量分析的方法。


許多物質是光致發光的,即它們可吸收電磁輻射,然后重新發射出相同或更長波長的輻射。光致發光最常見的類型是熒光和磷光。利用熒光強度進行分析的方法稱為熒光法。在熒光分析中,待測物質分子成為激發態時所吸收的光稱為激發光,處于激發態的分子回到基態時所產生的熒光稱發射光。熒光法測定的是待測物質分子受光激發后所發射的熒光的強弱,而不是測激發光的強弱。凡能產生熒光的化合物均可采用熒光分析法來進行定性或定量測量。


散射光譜技術是測定光線通過溶液混懸顆粒后的光吸收或光散射程度的一類定量測量方法,主要用于免疫檢測系統中,常稱免疫濁度法。


電化學分析法 


利用物質的電化學性質測定化學電池的電位、電流或電量變化來進行分析的方法稱電化學分析法。電化學分析法有多種,測定原電池電動勢以求物質含量的分析方法稱為電位法或電位分析法;通過對電阻的測定以求物質含量的分析法稱為電導法;借助某些物理量的突變作為滴定分析終點的指示,稱為電容量分析法。目前在臨床中應用的電化學分析法主要是離子選擇電位分析法,該方法利用電極電位及溶液內活性物質兩者間的關系來進行分析。


從方法學角度,可將臨床免疫診斷試劑分為免疫比濁法(在散射光譜技術中已介紹)、酶聯免疫法、化學發光等不同類型。


酶聯免疫法 


該技術是將酶高效催化反應的專一性和抗原抗體反應的特異性結合的一種免疫標記檢測技術。其原理是,將酶與抗體或抗原結合成酶標記結合物,酶標記結合物既保留了抗原或抗體的免疫學活性,又保留了酶對底物的催化活性,在酶標記抗體與抗原的特異性反應完成后,加入酶作用的相應底物,通過酶催化底物完成顯色反應,對抗原或抗體進行定位、定性和定量測定。


免疫熒光技術 該技術是利用物質吸收光能后產生激發態而發光的特性,將具有這種特性的熒光素用化學方法結合在特異的抗體或抗原上,又不損害其抗體或抗原活性的一種熒光顯微鏡下的示蹤技術。


流式細胞術 


該技術是對單細胞或其他生物粒子膜表面及內部的成分進行定量分析和分選的檢測手段,它可高速分析上萬個細胞,并能同時從一個細胞中測得多個參數。同傳統的熒光鏡檢查相比,該方法具有速度快、準確度高等特點。


膠體金技術 


該技術可按照液體的流動形式分為膠體金免疫滲濾試驗和膠體金免疫層析試驗。


化學發光免疫分析 


該技術是將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合,用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術?;瘜W發光免疫分析包含免疫反應系統和化學發光分析系統兩部分。


臨床分子生物學診斷試劑即通常所說的基因診斷試劑,其采用的技術原理主要包括核酸分子雜交技術、DNA測序技術、基因芯片技術等。


核酸分子雜交技術 該技術也稱基因探針技術,是利用核酸的變性、復性和堿基互補配對的原理,用已知的探針序列檢測樣本中是否含有與之配對的核苷酸序列的技術。該技術是臨床應用最早、最基礎的分子生物學技術,是印跡雜交、基因芯片等技術的基礎。


DNA序列分析 


該分析技術是分子生物學重要的基本技術。以某測序儀為例,其采用4種熒光染料分別標記終止物或引物,經Sanger測序反應后,反應產物帶有不同的熒光標記。一個樣品的4個測序反應產物可在同一泳道內電泳,從而降低測序泳道間遷移率差異對精確性的影響。通過電泳將各個熒光標記片段分開,同時,激光檢測器同步掃描,激發的熒光經光柵分光,以區分代表不同堿基信息的不同顏色熒光,并在CCD攝影機上同步成像。電腦可在電泳過程中對儀器運行情況進行同步檢測,結果能以電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等方式輸出。此方法測序為一代測序的基本原理。


高通量測序技術是對傳統測序的革命性改變,可一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。第二代測序技術將片段化的基因組DNA兩側連上接頭,隨后用不同的方法產生幾百萬個空間固定的PCR克隆陣列。目前該技術已發展到第三代測序技術,即單分子測序技術。

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